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是一種常用于研究中分離和鑒定蛋白質(zhì)的技術(shù)。它利用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 來分離指定樣品中包含的各種蛋白質(zhì)，然后將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或 PVDF 膜上，接下來將膜與對感目標蛋白質(zhì)的特異抗體一起孵育。在洗膜過程中，未結(jié)合的抗體被洗掉，只留下與目標蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體，最后通過顯影膠片或熒光掃描來檢測結(jié)合的抗體。

由于抗體僅與目標蛋白質(zhì)結(jié)合，因此一般只能看到一條清晰的帶，條帶的粗細對應(yīng)于蛋白質(zhì)量。通過分析特定反應(yīng)的位置和強度，可以獲得目標蛋白在給定細胞或組織勻漿中的表達信息。由于凝膠電泳的高分辨率和免疫的強特異性和高靈敏度，Western印跡分析可檢測低至1ng的靶蛋白。該方法廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫遺傳學(xué)等分子生物學(xué)領(lǐng)域。

在操作過程中常出現(xiàn)的問題以及解決辦法：

1. 多條帶或雜帶：

可能原因包括：目標蛋白具有多種修飾形式、使用多克隆抗體導(dǎo)致非特異性條帶較多、上樣量過高

解決方法：根據(jù)雜帶和目標條帶的距離決定是否進行裁膜處理或更換單克隆抗體，調(diào)整上樣量

2. 條帶不均勻或扭曲：

原因可能包括：電泳速度、電壓或溫度過高導(dǎo)致膠變形，凝膠和玻璃擋板底部的氣泡等

解決方法：減慢電泳速度，在冷室中電泳或調(diào)整pH值，充分混合并排除氣泡

3. 膜上出現(xiàn)黑點或黑斑：

可能原因包括：膜處理不當(dāng)、封閉劑與抗體之間的交叉反應(yīng)。

解決方法：檢查膜的處理步驟，更換封閉劑種類。

是酶免疫測定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應(yīng)板 ) 表面，使酶標記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的 ELISA 法有雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測大分子抗原，后者用于測定特異抗體。

在操作過程中常出現(xiàn)的問題以及解決辦法：

1. 標準曲線問題：

問題：標準曲線顯色過強或線性不佳。

解決辦法：確保標準品完全溶解并充分混合，調(diào)整捕獲抗體和檢測抗體的比例。

2. 顯色不全或花板現(xiàn)象：

問題：顯色不全或整個板呈現(xiàn)陽性O(shè)D值。

解決辦法：確保底物溶液新鮮且正確混合，避免底物溶液變藍或沉淀。

3. 吸光度值異常：

問題：吸光度值偏高或低，或者吸光度不一致。

解決辦法：重新評估測定方法，調(diào)整稀釋度，確保移液器正常工作和校準，充分混合試劑和樣品。

是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。其原理是：當(dāng)細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。

在操作過程中常出現(xiàn)的問題以及解決辦法：

1．裂解液的選擇：裂解液中的去垢劑濃度過高或配方過于劇烈可能導(dǎo)致目標蛋白無法被有效釋放。在這種情況下，降低去垢劑濃度或更換去垢劑種類可能有助于改善結(jié)果。

2．抗體的選擇：選擇合適的抗體是Co-IP成功的關(guān)鍵。建議使用先前已被證明可以沉淀目標蛋白的抗體，并盡量選擇多克隆抗體，因為它們可以在多個位點結(jié)合目標蛋白，從而增加捕獲成功率

3．樣品制備：樣品制備過程中，細胞裂解緩沖液的選擇非常重要。對于可溶性蛋白，通常使用非去污劑、低鹽裂解緩沖液；而對于不太可溶的蛋白復(fù)合物，則可能需要使用含有非離子去污劑如NP-40或Triton X-100的裂解緩沖液